Вектор клонирования
-
Клонирующий вектор
- Небольшой фрагмент ДНК, поддерживаемый в организме и используемый для клонирования чужеродных фрагментов ДНК
- Содержит элементы для удобного вставки и удаления фрагментов ДНК
-
Процесс клонирования
- Обработка рестрикционным ферментом для получения фрагментов ДНК с тупыми или липкими концами
- Соединение фрагментов ДНК молекулярным лигированием
- Возможность субклонирования в другой вектор для более специфического использования
-
Типы векторов клонирования
- Плазмиды: наиболее часто используемые, поддерживают ДНК до 15 кбайт
- Бактериофаги: фаг λ и фаг M13, поддерживают ДНК до 53 т.п.н.
- Космиды: плазмиды с сегментом λ-ДНК, поддерживают ДНК до 45 т.п.н.
- Бактериальные искусственные хромосомы (BAC): поддерживают ДНК до 350 кбайт
-
Искусственные хромосомы дрожжей
- Используются для клонирования фрагментов ДНК более 1 МБ
- Содержат теломерную последовательность и автономно реплицирующуюся последовательность
- Включают подходящие сайты рестрикции и гены для селективных маркеров
-
Искусственная хромосома человека
- Может нести очень большие фрагменты ДНК
- Избегает инсерционного мутагенеза
- Используется для доставки генов в клетки человека и изучения экспрессии хромосом
-
Переносчики вирусов животных и растений
- Вирусы используются для внедрения чужеродных генов в клетки растений и животных
- Вектор на основе SV40 был первым использован для клонирования клеток млекопитающих
- Ретровирусные векторы популярны для клонирования генов в клетках млекопитающих
- Вирусы мозаики цветной капусты, табачной мозаики и Джемини использовались с ограниченным успехом
-
Скрининг: пример сине-белого экрана
- Векторы общего назначения включают систему для обнаружения клонированного фрагмента ДНК
- Ген, кодирующий E. β-галактозидазу, используется для определения активности фермента
- Клонирование фрагмента ДНК предотвращает выработку активного фермента
- Колонии трансформантов имеют синий цвет при отсутствии ДНК и белый при наличии ДНК