Agarose gel electrophoresis
-
Agarose gel electrophoresis
- Метод разделения макромолекул в агаровом геле
- Используется в биохимии, молекулярной биологии, генетике и клинической химии
- Разделение по заряду и размеру, ДНК и РНК по длине
-
Свойства агарового геля
- Трехмерная матрица из спиральных молекул агарозы
- Температура плавления 85-95 °C, температура гелеобразования 35-42 °C
- Подходит для разделения ДНК и крупных белков
- Поры размером 100-500 нм, прочность позволяет использовать гели низкой концентрации
-
Электрофорез в агаровом геле
- Факторы, влияющие на миграцию: размер пор, размер ДНК, напряжение, ионная сила, концентрация красителя
- ДНК движется медленнее в геле, чем в растворе
- Суперспирализованная ДНК движется быстрее, чем расслабленная
- Ethidium bromide влияет на движение ДНК
-
Механизм миграции и разделения
- Отрицательный заряд ДНК движется к аноду
- Гель матрица разделяет молекулы по размеру
- Модель Огастона объясняет разделение через поры
- Для крупных молекул используется модель рептации
-
Процедура электрофореза
- Подготовка геля: растворение агарозы в буфере, нагревание, охлаждение, заливка в форму
- Создание лунок для загрузки образца, полное застывание геля перед использованием
-
Влияние концентрации геля на разрешение ДНК
- Высокая концентрация геля улучшает разделение мелких молекул ДНК, низкая концентрация позволяет разделять крупные молекулы.
- Для стандартного электрофореза используется 0.8% гель для крупных фрагментов и 2% гель для мелких.
- 1% гель часто используется для стандартного электрофореза.
-
Загрузка образцов
- После застывания геля удаляются гребни, оставляя лунки для загрузки образцов.
- Образцы загружаются в лунки с помощью пипетки.
- Загрузка буфера включает глицерин, сахарозу или фиколл для повышения плотности образца.
-
Электрофорез
- Электрофорез обычно проводится горизонтально в субаквальном режиме.
- Для оптимального разрешения ДНК более 2 kb рекомендуется напряжение 5-8 В/см.
- Напряжение может быть ограничено нагревом геля и риском его плавления.
- Для контроля используются цветные красители, такие как ксиленцианол и бромфеноловый синий.
-
Окрашивание и визуализация
- ДНК и РНК обычно окрашиваются этидиум бромидом, который флуоресцирует под УФ-светом.
- Другие методы окрашивания включают MIDORI Green, SYBR Green, GelRed и другие.
- SYBR Green требует использования синего света, а кристалл виолет можно использовать без УФ-света.
-
Последующие процедуры
- Разделенные ДНК-полоски используются для дальнейших процедур, таких как ПЦР.
- Буферы должны иметь хорошую проводимость, низкую температуру и длительный срок службы.
- TAE и TBE являются распространенными буферами для нуклеиновых кислот.
-
Применение
- Оценка размера ДНК после рестрикции.
- Анализ продуктов ПЦР.
- Разделение ДНК и РНК для экстракции и очистки.
- Разделение белков для скрининга.
- Легкость использования и хранения гелей.
-
Внешние ссылки
- Как запустить ДНК- или РНК-гель
- Анимация гелевого анализа рестрикционных фрагментов ДНК
- Видео и статья об электрофорезе в агарозном геле
- Пошаговые фотографии применения геля и извлечения ДНК
- Электрофорез через соломинку для питья!
- Типичный метод из викиверситета
- Создание камеры для гель-электрофореза