Cas9
-
Cas9: основная функция и применение
- Cas9 — белок массой 160 килодальтон, участвующий в иммунологической защите бактерий и генной инженерии.
- Основная функция — разрезание ДНК и изменение генома клетки.
- Технология CRISPR-Cas9 получила Нобелевскую премию по химии в 2020 году.
-
Механизм работы CRISPR-Cas9
- Cas9 — фермент ДНК-эндонуклеаза, управляемый РНК.
- Используется для анализа и расщепления чужеродной ДНК.
- Механизм аналогичен РНК-интерференции у эукариот.
-
Использование в генной инженерии
- Cas9 индуцирует сайт-направленные двухцепочечные разрывы в ДНК.
- Применяется для инактивации генов и внедрения гетерологичных генов.
- Разработаны варианты Cas9 для преодоления ограничений редактирования генома.
-
Иммунитет, опосредованный CRISPR
- CRISPR-Cas9 используется бактериями для защиты от вирусов.
- Локусы CRISPR состоят из коротких палиндромных повторов и переменных спейсеров.
- Cas9 распознает и расщепляет чужеродную ДНК.
-
Типы и подтипы CRISPR-Cas
- Системы CRISPR-Cas делятся на три типа и двенадцать подтипов.
- Основные определяющие характеристики — гены cas и их белки.
-
Этапы защиты CRISPR-Cas
- Адаптация включает распознавание и интеграцию спейсеров.
- Обработка CRISPR включает транскрипцию и расщепление пре-крРНК.
- Интерференция включает распознавание и расщепление чужеродной ДНК.
-
Деактивация транскрипции с помощью dCas9
- dCas9 подавляет экспрессию генов, прекращая удлинение цепи РНК.
- dCas9 может быть использован с промотором для запуска или остановки транскрипции.
-
Подавление транскрипции с помощью dCas9
- dCas9 взаимодействует с пептидом FOG1, метилируя H3K27.
- Это взаимодействие вызывает репрессию гена и прекращение транскрипции.
-
Изменение белков и регуляция генов
- dCas9 предотвращает размножение повторяющихся кодонов и последовательностей ДНК.
- В растениях dCas9 регулирует производство генов для изменения характеристик.
- В бактериях dCas9 ингибирует РНК-полимеразу, препятствуя транскрипции.
-
Структурные и биохимические исследования
- dCas9 имеет двулопастную архитектуру с нуклеазной и альфа-спиральной долями.
- Домен RuvC расщепляет нецелевую цепь ДНК, домен HNH — целевую цепь.
- Cas9 распознает PAM-мотив и взаимодействует с CRISPR-РНК.
-
Взаимодействие с sgRNA
- Домены REC1, BH и PI взаимодействуют с остовом sgRNA.
- Мутанты Cas9 с делецией доменов REC1 и BH проявляют низкую активность.
-
Расщепление ДНК
- Cas9 содержит нуклеазные домены HNH и RuvC.
- Для расщепления ДНК требуются кофакторы магния, но Cas9 может работать с другими металлами.
- Эффективность расщепления зависит от наличия PAM и нуклеотидного состава.
-
Проблемы с редактированием Cas9 у бактерий
- Бактерии могут внедрять чужеродную ДНК и использовать систему модификации рестрикции.
- Эти системы могут препятствовать редактированию Cas9.
-
Применение Cas9 для настройки транскрипции
- dCas9 используется для подавления транскрипции с помощью направляющих РНК.
- dCas9 может конкурировать с РНК-полимеразой на промоторах и в кодирующих областях.
- Направляющие РНК могут включать несоответствия для настройки степени подавления.
-
Преимущества dCas9 перед RNAi
- Меньше побочных эффектов
- Более выраженные и воспроизводимые эффекты подавления генов
- Возможность количественного контроля степени подавления генов
-
Функции dCas9
- Связывание с транскрипционно чувствительными участками локусов
- Присоединение к модулирующим белковым доменам
-
Ремоделирование хроматина
- Слияние с белками HDACs/HATs для реорганизации структуры хроматина
- Нацеливание на эукариотические гены
- Возможность изучения структуры хроматина
-
Полногеномные скрининги
- Использование больших библиотек направляющих РНК
- Воздействие на тысячи генов
-
Прямое расщепление мРНК
- Гибридизация оцДНК с оцРНК для создания сайта PAM
- Выделение эндогенных РНК-транскриптов без химических модификаций
-
Активация транскрипции
- Соединение с факторами, активирующими транскрипцию
- Полногеномные скрининги активации транскрипции с использованием CRISPRa