Оглавление
- 1 Флуоресцентный микроскоп
- 1.1 Принцип работы флуоресцентного микроскопа
- 1.2 Компоненты флуоресцентного микроскопа
- 1.3 Эпифлуоресцентная микроскопия
- 1.4 Источники света
- 1.5 Подготовка образцов
- 1.6 Биологические флуоресцентные пятна
- 1.7 Иммунофлуоресценция
- 1.8 Флуоресцентные белки
- 1.9 Ограничения
- 1.10 Методы субдифракции
- 1.11 Методы субдифракционного разрешения
- 1.12 Альтернативные методы
- 1.13 Примеры флуоресцентной микроскопии
- 1.14 Полный текст статьи:
- 2 Флуоресцентный микроскоп – Arc.Ask3.Ru
Флуоресцентный микроскоп
-
Принцип работы флуоресцентного микроскопа
- Флуоресцентный микроскоп использует флуоресценцию для получения изображения.
- Свет определенной длины волны поглощается флуорофорами, которые излучают свет с большей длиной волны.
- Освещающий свет отделяется от флуоресценции с помощью спектрального эмиссионного фильтра.
-
Компоненты флуоресцентного микроскопа
- Источник света (ксеноновая дуговая лампа, ртутьсодержащая лампа, лазеры, светодиоды).
- Фильтр возбуждения, дихроичное зеркало, эмиссионный фильтр.
- Фильтры и дихроичный светоделитель выбираются в соответствии со спектральными характеристиками флуорофора.
-
Эпифлуоресцентная микроскопия
- Свет с длиной волны возбуждения освещает образец через линзу объектива.
- Флуоресценция фокусируется на детекторе тем же объективом.
- Дихроичный светоделитель пропускает флуоресцентный свет и отражает возбуждающий свет.
-
Источники света
- Используются ксеноновые дуговые лампы, ртутные лампы, лазеры, светодиоды.
- Лазеры наиболее широко используются для сложных методов, ксеноновые лампы и светодиоды для эпифлуоресцентных микроскопов.
-
Подготовка образцов
- Образцы должны быть флуоресцентными, что достигается маркировкой красителями или экспрессией флуоресцентного белка.
- В биологии флуоресцентная микроскопия используется для специфического окрашивания белков и других молекул.
-
Биологические флуоресцентные пятна
- Флуоресцентные красители связываются с биологическими молекулами, такими как ДНК, белки, клеточные структуры.
- Примеры: DAPI, Hoechst, DRAQ5, DRAQ7, фаллоидин, гибридизующий коллаген пептид.
-
Иммунофлуоресценция
- Использует антитела для маркировки специфических белков.
- Первичное антитело связывается с антигеном, вторичное антитело с флуорофором.
-
Флуоресцентные белки
- Генетически модифицированные белки несут флуоресцентный репортер.
- Позволяют отслеживать местоположение белка в живых клетках.
-
Ограничения
- Флуорофоры теряют способность флуоресцировать при фотообесцвечивании.
- Флуоресцентная микроскопия позволяет наблюдать только помеченные структуры.
- Вычислительные методы могут уменьшить фототоксичность.
-
Методы субдифракции
- Флуоресцентная микроскопия преодолевает дифракционный предел с помощью специализированных оптических конфигураций.
- Микроскоп 4Pi использует два противоположных объектива для увеличения количества направлений фокусировки.
- Интегрированная корреляционная микроскопия сочетает флуоресцентный и электронный микроскопы.
-
Методы субдифракционного разрешения
- STED-микроскопия (1994) основана на сильном нелинейном взаимодействии света и флуоресцирующих молекул
- Широкопольная микроскопия (1990-е) улучшила разрешение по размерам клеточных наноструктур
- SPDM и SMI (Vertico SMI) объединили принципы SPDM и SMI для разработки микроскопа Vertico SMI
- SPDMphymod позволяет обнаруживать и подсчитывать два типа флуоресцентных молекул (2CLM)
-
Альтернативные методы
- Фотоактивируемая локальная микроскопия использует мигание или переключение молекул для субдифракционного разрешения
-
Примеры флуоресцентной микроскопии
- Z-проекция клетки остеосаркомы с фаллоидином для визуализации актиновых нитей
- Эпифлуоресцентная визуализация трех компонентов в раковой клетке человека
- Эндотелиальные клетки с различными флуорофорами для визуализации ядер, микротрубочек и актиновых нитей
- 3D-двухцветная микроскопия с использованием Her2 и Her3 в клетках молочной железы
- Микроскопия ЛИМОНА с гибридизованными центромерными зондами на хромосомах
- Микроскопия с высоким разрешением: обнаружение одной молекулы YFP в раковой клетке человека
- Микроскопия с совместной локализацией белков слияния GFP и RFP в ядре клетки рака кости
- Флуоресцентная микроскопия экспрессии ДНК у человека дикого типа и мутанта P239S Палладина
- Флуоресцентная микроскопия патологических солнечных вспышек в клетках крови