Карта ограничений
-
Карта рестрикции
- Карта известных сайтов рестрикции в ДНК
- Используется для создания плазмид и геномной ДНК
- Существуют другие методы отображения признаков ДНК
-
Секвенирование и рестрикционное картирование
- Секвенирование всей молекулы ДНК
- Компьютерная программа находит сайты распознавания
- До автоматизации секвенирование было дорогим
-
Определение положения сайтов рестрикции
- Однократный и двойной рестрикционный анализы
- Размеры фрагментов ДНК указывают на расположение сайтов
- Отображение ограничений полезно для ориентации вставки
-
Экспериментальная процедура
- Получение очищенной плазмидной ДНК
- Переваривание с выбранными ферментами
- Обработка в геле для электрофореза
- Суммирование размеров фрагментов
-
Проблемы и их решение
- Фрагменты могут скатиться с края геля
- Гель может быть недостаточно плотным
- Если фрагменты суммируются, можно определить положение сайтов REN
-
Быстрая денатурация и ренатурация ДНК
- Лизис клеток в щелочных условиях
- Денатурация ДНК разрушением водородных связей
- Геномная ДНК образует нерастворимый агрегат
- Сверхспиральные плазмиды остаются в растворе
- Экстракция фенолом и осаждение этанолом для концентрирования образца