Оглавление
Reverse transcription polymerase chain reaction
-
История и принципы RT-PCR
- RT-PCR сочетает обратную транскрипцию РНК в ДНК и амплификацию ДНК с помощью ПЦР.
- Используется для измерения количества РНК.
- Мониторинг реакции с помощью флуоресценции (qPCR).
-
Различия между RT-PCR и qPCR
- RT-PCR используется для молекулярного клонирования, секвенирования и простого обнаружения РНК.
- qPCR используется для количественного анализа ДНК.
- RT-PCR может быть использован без qPCR, а qPCR без RT-PCR.
-
История и развитие
- RT-PCR заменил Northern blot как метод выбора для количественного анализа РНК.
- RT-PCR обеспечивает широкий диапазон измерения РНК и предоставляет как качественные, так и количественные данные.
-
Принципы RT-PCR
- РНК преобразуется в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы.
- КДНК используется как шаблон для амплификации с помощью ПЦР.
-
Одно- и двухступенчатый RT-PCR
- Одноступенчатый RT-PCR выполняется в одной пробирке, что минимизирует экспериментальные вариации.
- Двухступенчатый RT-PCR требует разделения реакций на две пробирки, что снижает риск загрязнения.
-
End-point и real-time RT-PCR
- End-point RT-PCR используется для измерения изменений экспрессии генов в небольших образцах.
- Real-time RT-PCR является золотым стандартом для валидации результатов и анализа экспрессии генов на глобальном уровне.
-
Применение RT-PCR
- Используется для диагностики генетических заболеваний и определения экспрессии генов.
- Применяется в исследованиях для измерения экспрессии генов и вставки эукариотических генов в прокариоты.
- Используется для диагностики рака и мониторинга реакции на терапию.
-
RT-PCR: применение и проблемы
- RT-PCR используется для изучения геномов вирусов с РНК, таких как грипп и SARS-CoV-2.
- Метод имеет недостатки, такие как экспоненциальный рост кДНК и необходимость в qRT-PCR для точного определения количества РНК.
- Высокая чувствительность метода может привести к ложным результатам при загрязнении ДНК.
-
Методы RT-PCR
- RT-PCR может быть одноэтапным или двухэтапным.
- Одноэтапный метод включает обратную транскрипцию и ПЦР в одной пробирке, требует высокого качества РНК и специфичного праймера.
- Двухэтапный метод включает обратную транскрипцию отдельно от ПЦР, более чувствителен, но требует больше времени.
-
Стандартизация и рекомендации
- Количественный RT-PCR считается золотым стандартом, но плохо стандартизирован.
- MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) guidelines стандартизируют экспериментальные условия и номенклатуру.
- MIQE включает элементы экспериментального дизайна, образца, экстракции нуклеиновых кислот, обратной транскрипции, информации о целевых генах, олигонуклеотидов, протокола, валидации и анализа данных.
- Элементы с меткой E считаются критическими, а с меткой D — важными для лучших практик.