Последовательность действий дробовика
-
Метод дробового секвенирования
- Используется для секвенирования случайных цепочек ДНК
- Назван по аналогии с выстрелами из дробовика
- Применяется для коротких цепей ДНК (100-1000 пар оснований)
-
Процесс секвенирования
- ДНК разбивается на множество сегментов
- Секвенирование методом обрыва цепи для получения считываний
- Компьютерные программы собирают перекрывающиеся считывания в непрерывную последовательность
-
История и применение
- Впервые предложено в 1979 году
- Первый геном, секвенированный методом дробовика, вирус мозаики цветной капусты (1981)
- Попарное секвенирование концов (1990)
- Стратегия чистого попарного секвенирования концов (1991)
- Применение для секвенирования геномов бактерий и дрозофилы (1995-2000)
-
Подход и сборка
- ДНК разрезают на фрагменты, клонируют и секвенируют с обоих концов
- Перекрывающиеся считывания собираются в контиги
- Контиги соединяются в каркасы с помощью сопряженных пар
-
Плюсы и минусы
- Быстрое секвенирование больших участков ДНК
- Сомнения в правильности связывания участков для геномов эукариот
- Потенциал преодоления ограничений с развитием программ сборки и вычислительных мощностей
-
Покрытие и иерархическая последовательность
- Охват (глубина считывания) рассчитывается по длине генома и количеству считываний
- Иерархическое секвенирование: создание физической карты генома, выбор минимального количества фрагментов для секвенирования
- Амплификация генома, клонирование в бактерии, определение минимального пути укладки плитки
- Определение порядка клонов с помощью гибридизации с микрочипом
-
Методы геномного картирования
- Метод «хождение по хромосомам» использует секвенирование концов клонов для получения новых зондов.
- Рестрикционный или BAC-фингерпринтинг идентифицирует сайты рестрикции в клонах.
- Иерархическое секвенирование методом дробовика создает карту генома с низким разрешением.
-
Преимущества и недостатки иерархического секвенирования
- Иерархическое секвенирование медленнее, но менее зависит от компьютерных алгоритмов.
- Создание обширной библиотеки BAC и выбор пути разбиения на листы трудоемки.
-
Современные технологии секвенирования
- Классическое секвенирование методом дробовика основано на методе Сэнгера.
- Секвенирование с коротким считыванием и секвенирование с длительным считыванием позволяют получать короткие считывания и высокий охват.
- Эти технологии требуют больших вычислительных затрат, но превосходят секвенирование по Сэнгеру.
-
Метагеномное дробовое секвенирование
- Считывания длиной 400-500 пар оснований позволяют определить вид или штамм организма.
- Миллионы считываний позволяют получить полный обзор сложного микробиома.
- Преимущества включают классификацию на уровне штаммов и возможность выделения целых генов.
- Метагеномное секвенирование чувствительно и привлекательно для клинического применения, но требует осторожности из-за загрязнения образца.