Проточная цитометрия
-
История и развитие проточной цитометрии
- Проточная цитометрия (ФЦ) используется для обнаружения и измерения характеристик клеток и частиц.
- Первое устройство на основе импеданса было разработано в 1953 году.
- Фулвайлер разработал устройство для сортировки клеток в 1965 году.
- Первое устройство на основе флуоресценции было разработано в 1968 году.
-
Основные компоненты и принцип работы
- Проточный цитометр состоит из проточной ячейки, измерительной системы, детектора, системы усиления и компьютера.
- Клетки проходят через лазерный луч, рассеивая свет, который затем анализируется.
- Клетки помечаются флуоресцентными маркерами для поглощения и испускания света.
-
Области применения
- Подсчет клеток
- Сортировка ячеек
- Определение характеристик и функций клеток
- Обнаружение микроорганизмов
- Обнаружение биомаркеров
- Диагностика заболеваний
- Измерение размера генома
-
Современные проточные цитометры
- Современные приборы способны анализировать тысячи частиц в секунду.
- Проточные цитометры могут быть сконфигурированы как сортировщики клеток.
- Проточный цитометр аналогичен микроскопу, но обеспечивает автоматизированную количественную оценку.
-
Оборудование и технологии
- Жидкостная система перемещает клетки через лазерный луч.
- Гидродинамическая фокусировка используется для точного позиционирования клеток.
- Акустическая фокусировка поддерживает гидродинамическую фокусировку.
- Оптические фильтры и дихроичные зеркала фильтруют свет для повышения специфичности.
- Призмы и решетки используются для измерения полного спектра каждой частицы.
- Визуализирующая проточная цитометрия позволяет получать многоканальные изображения клеток.
-
Анализ данных
- Компенсация используется для коррекции спектрального перекрытия между флуорохромами.
- Линейная алгебра используется для выполнения коррекции.
- Графики параметров показывают, что другие параметры не влияют на распределение.
-
Проблемы многомерных параметров
- Проблема становится серьезной при использовании параметров, превышающих двойные.
- В настоящее время нет эффективных инструментов для отображения многомерных параметров.
-
Компенсация и анализ данных
- Компенсация важна для различения клеток.
- Данные могут быть нанесены на график в одном, двух или трех измерениях.
- Графики часто делаются в логарифмическом масштабе.
- Спектры излучения перекрываются, сигналы должны быть скомпенсированы.
- Данные анализируются с помощью программного обеспечения.
-
Вычислительный анализ
- Автоматизированные системы идентификации помогают в обнаружении редких популяций.
- Примеры методов: FLOCK, SamSPECTRAL, flowClust, FLAME.
- T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (tSNE) используется для визуализации данных.
-
Элементы управления FMO
- Контроль флуоресценции минус один важен для многоцветных панелей.
- Элементы управления FMO обеспечивают компенсацию.
-
Сортировка клеток методом проточной цитометрии
- Сортировка клеток основана на физических характеристиках.
- Первый прототип был построен в 1965 году.
- Процесс включает введение образца в поток жидкости, лазерное измерение и электростатическую сортировку.
-
Этикетки и флуоресцентные метки
- Проточная цитометрия использует метки для идентификации клеток.
- Флуорофоры присоединяются к антителам или химическим веществам.
- Квантовые точки и изотопная маркировка также используются.
-
Набор цитометрических шариков
- Измеряет клеточные продукты, такие как цитокины и белки.
- Использует биотинилированные антитела и стрептавидин-R-фикоэритрин.
-
Импедансная проточная цитометрия
- Основана на импедансе, используется для подсчета и определения размеров клеток.
- Технология без этикеток позволяет проводить высокоточный анализ.
-
Поддающиеся измерению параметры
- Апоптоз, адгезия клеток, жизнеспособность и другие параметры могут быть количественно определены.
-
Клеточные пигменты и поверхностные антигены
- Проточная цитометрия измеряет присутствие и количество пигментов хлорофилла и фикоэритрина.
- Используется для идентификации и количественного определения поверхностных антигенов клеток (CD).
-
Жизнеспособность клеток
- Проточная цитометрия определяет жизнеспособность клеток с помощью флуоресцентных красителей.
- Жизнеспособность клеток должна составлять около 95%.
-
Циркулирующие опухолевые клетки
- Проточная цитометрия выделяет и очищает циркулирующие опухолевые клетки (CTC).
- CTC помогают в диагностике рака, прогнозировании и мониторинге лечения.
-
Определение множественной лекарственной устойчивости
- Проточная цитометрия оценивает множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) в раковых клетках.
- Помогает понять лекарственную устойчивость и бороться с ней.
-
Анализ и сортировка хромосом
- Проточная цитометрия помогает анализировать и сортировать хромосомы.
- Создает библиотеки и выявляет хромосомные аномалии.
-
Изменение количества копий ДНК
- Проточная цитометрия измеряет изменение количества копий ДНК.
- Помогает понять генетические изменения, связанные с заболеваниями.
-
Экспрессия и модификации белков
- Проточная цитометрия оценивает уровни экспрессии белков и их изменения.
- Способствует лучшему пониманию функций белков и сигнальных сетей.
-
Текучесть мембран
- Проточная цитометрия определяет текучесть мембран с помощью флуоресцентных зондов.
- Дает информацию о динамике и функционировании клеточных мембран.
-
Общее содержание ДНК и РНК
- Проточная цитометрия измеряет общее содержание ДНК и РНК в клетках.
- Данные полезны для анализа клеточного цикла и определения изменений экспрессии генов.
-
Мониторинг внутриклеточных параметров
- Проточная цитометрия измеряет внутриклеточные факторы, включая рН, уровни кальция и магния, мембранный потенциал и уровень глутатиона.
- Данные дают информацию о клеточном метаболизме и передаче сигналов.
-
Светорассеяние
- Показатели прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) используются для оценки объема клеток и морфологической сложности.
-
Трансгенные продукты
- Проточная цитометрия полезна для оценки трансгенных продуктов in vivo.
- Позволяет исследовать экспрессию генов, локализацию белков и клеточную динамику.
-
Различные комбинации
- Проточная цитометрия интегрирует множество измеряемых данных для получения всестороннего представления о биологических особенностях и функциях.
-
Приложения
- Проточная цитометрия используется в молекулярной биологии, патологии, иммунологии, вирусологии, биологии растений и морской биологии.
- Применяется в медицине, особенно в трансплантологии, гематологии, иммунологии опухолей и химиотерапии.
-
Водные исследования
- Проточная цитометрия используется для анализа автофлуоресцирующих клеток и клеток, помеченных флуоресцентными красителями.
- Позволяет отличать клетки фитопланктона от неживого материала и выделять цианобактерии.
-
Анализ клеточной пролиферации
- Проточная цитометрия с использованием CFSE помогает контролировать пролиферацию клеток.
- Используется для определения эффективности Т-лимфоцитов в уничтожении клеток-мишеней при раке.
-
Измерение размера генома
- Проточная цитометрия используется для измерения размеров генома.
- Результирующие размеры генома могут отличаться в зависимости от используемого красителя.
-
Смотрите также
- Тканевая цитометрия переносит концепцию проточной цитометрии на срезы тканей in situ.
- Анализ сродства к аннексину А5 часто использует проточную цитометрию.
- Анализ клеточного цикла, сошниковый счетчик, цитометрия, диэлектрофорез, европоток, массовая цитометрия, микрофлуориметрия, анализ жизнеспособности.