Репликация ДНК
-
Репликация ДНК
- Процесс получения двух идентичных копий ДНК из одной исходной молекулы
- Важна для деления клеток и восстановления тканей
- ДНК состоит из двойной спирали, состоящей из двух комплементарных нитей
-
Структура ДНК
- ДНК состоит из четырех типов нуклеотидов: аденин, цитозин, гуанин, тимин
- Нуклеотиды образуют фосфодиэфирные связи и водородные связи
- Нити ДНК антипараллельны, 5′-конец одной нити является 3′-концом другой
-
ДНК-полимераза
- Фермент, осуществляющий синтез ДНК
- Добавляет нуклеотиды к 3′-концу цепи ДНК
- Высокая точность, менее одной ошибки на 107 нуклеотидов
-
Процесс репликации
- Включает инициацию, удлинение и завершение
- Инициация начинается в источниках репликации
- Комплекс для предварительной репликации включает белки-инициаторы
- Комплекс Mcm расщепляет спираль ДНК
-
Контроль репликации
- Активация комплексов G1 и G1/S циклин-Cdk стимулирует экспрессию генов
- Активация S-Cdk может активировать источники репликации
- Контроль варьируется в зависимости от типа клеток и стадии развития
-
Регуляция репликации ДНК у дрожжей
- S-циклины Clb5 и Clb6 запускают активацию источников репликации.
- Cdc7 также необходим для активации источников репликации, но его активность строго ограничена.
-
Комплекс предварительной инициации
- Активация S-Cdk и Cdc7 приводит к образованию комплекса предварительной инициации.
- Комплекс вытесняет Cdc6 и Cdt1, активирует геликазу Mcm и загружает ДНК-полимеразы.
-
Удлинение ДНК
- ДНК-полимераза обладает активностью 5′-3′.
- Известны четыре механизма синтеза ДНК: праймаза, транспортная РНК, концевой белок и RCR.
- Клеточные организмы используют праймазу для синтеза РНК-праймеров.
-
Роль ДНК-полимераз
- В E. coli DNA Pol III отвечает за репликацию ДНК.
- DNA Pol I заменяет праймеры РНК на ДНК.
- У эукариот Pol α помогает инициировать репликацию.
-
Вилка репликации
- Репликационная вилка образуется ферментами геликазами.
- Ведущая нить синтезируется непрерывно, отстающая нить синтезируется в виде коротких сегментов.
-
Динамика на развилке репликации
- Геликаза раскручивает ДНК, создавая нагрузку на кручение.
- Топоизомеразы временно разрывают нити ДНК, снимая напряжение.
- Одноцепочечные связывающие белки предотвращают образование вторичной структуры ДНК.
- Гистоновые шапероны разбирают хроматин перед репликацией.
-
Механизм репликации ДНК
- Фиксирующие белки действуют как скользящий зажим, позволяя ДНК-полимеразе связываться с матрицей.
- Белки, загружающие Clamp, распознают соединение между матрицей и РНК-праймерами.
- Реплисома включает ДНК-полимеразу, ДНК-геликазы, ДНК-фиксаторы и ДНК-топоизомеразы.
-
Фабрики репликации
- В эукариотических клетках реплисомы не образуются.
- Фабрики репликации распутывают сестринские хроматиды для распределения по дочерним клеткам.
-
Прекращение репликации
- Эукариоты инициируют репликацию в нескольких точках хромосомы.
- Теломеры предотвращают потерю генов, укорачиваясь в соматических клетках.
- В зародышевых клетках теломераза расширяет теломеры.
- У бактерий репликация прекращается при встрече двух репликационных вилок на противоположном конце хромосомы.
-
Регулирование репликации у эукариот
- Репликация контролируется в рамках клеточного цикла.
- Контрольная точка G1/S регулирует вступление в репликацию.
- S-Cdk и M-Cdk блокируют сборку комплекса перед репликацией.
- Геминин ингибирует сборку комплекса перед репликацией в клетках животных.
-
Репликация геномов хлоропластов и митохондрий
- Происходит независимо от клеточного цикла.
-
Фокус на тиражировании
- В клетках позвоночных сайты репликации концентрируются в очагах репликации.
- Источники репликации постоянно меняются в фазе G1 и S.
- Кластеризация ответвлений репликации предотвращает остановленные ответвления.
-
Бактериальная репликация
- Большинство бактерий непрерывно копируют ДНК.
- Во время быстрого роста может возникать несколько циклов репликации.
-
Механизмы регуляции репликации ДНК у E. coli
- Гемиметилирование и секвестрирование исходной последовательности
- Соотношение ATP и ADP
- Уровни белка DnaA
-
Гемиметилирование и SeqA
- E. coli метилирует последовательности GATC
- Гемиметилированная ДНК распознается белком SeqA
- DnaA хуже связывается с гемиметилированной ДНК
-
АТФ и репликация
- АТФ накапливается в богатой среде
- АТФ конкурирует с АДФ за связывание с ДНК
- Комплекс ДНК-АТФ инициирует репликацию
-
Белки ДНК и репликация
- Определенное количество белков ДНК требуется для репликации
- Количество сайтов связывания ДНК удваивается при каждом копировании
-
Перекрывающиеся циклы репликации
- Быстрорастущие бактерии инициируют новый цикл репликации до завершения предыдущего
- Новый цикл формирует хромосому клетки через два поколения
-
Проблемы с репликацией ДНК
- Неправильное включение рибонуклеотидов
- Необычные структуры ДНК
- Конфликты между репликацией и транскрипцией
- Недостаточность основных факторов репликации
- Общие уязвимые участки
- Избыточная экспрессия или конститутивная активация онкогенов
- Недоступность хроматина
-
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
- Исследователи реплицируют ДНК in vitro с помощью ПЦР
- Используется пара праймеров, охватывающих область-мишень
- Полимеризация цепочек-партнеров с помощью термостабильной ДНК-полимеразы
- Повторение процесса усиливает действие целевого участка ДНК
- Количество копий целевой области удваивается с каждым раундом