Оглавление
- 1 Секвенирование белков
- 1.1 Секвенирование белков
- 1.2 Определение аминокислотного состава
- 1.3 Деградация Эдмана
- 1.4 Идентификация с помощью масс-спектрометрии
- 1.5 Протеолитические переваривания
- 1.6 Выделение и модификация POI
- 1.7 Переваривание POI
- 1.8 Масс-спектрометрия пептидов
- 1.9 Альтернативные методы
- 1.10 Анализ данных
- 1.11 Повторное секвенирование
- 1.12 Ограничения и посттрансляционные модификации
- 1.13 Определение общей массы белка
- 1.14 Предсказание на основе последовательностей ДНК/РНК
- 1.15 Инструменты биоинформатики
- 1.16 Приложения к криптографии
- 1.17 Полный текст статьи:
- 2 Секвенирование белков
Секвенирование белков
-
Секвенирование белков
- Определение аминокислотной последовательности белка или пептида
- Частичное секвенирование для идентификации белка
- Методы масс-спектрометрии и разложения по Эдману
-
Определение аминокислотного состава
- Гидролиз белка для разделения аминокислот
- Разделение и количественная оценка аминокислот
- Анализ N-концевых аминокислот с помощью реагентов
- Анализ С-концевых аминокислот с помощью карбоксипептидаз
-
Деградация Эдмана
- Разрушение дисульфидных мостиков и защита от повторного образования
- Определение аминокислотного состава и концевых аминокислот
- Разбиение на пептидные фрагменты и их секвенирование
- Автоматизированные секвенаторы белков
-
Идентификация с помощью масс-спектрометрии
- Присвоение названия белку на основе аминокислотной последовательности
- Подтверждение N- и С-концов, определение вариантов последовательности и посттрансляционных модификаций
-
Протеолитические переваривания
- Общая схема идентификации белка
-
Выделение и модификация POI
- POI выделяют с помощью SDS-PAGE или хроматографии
- POI может быть химически модифицирован для стабилизации остатков цистеина
-
Переваривание POI
- POI переваривается протеазой, например, трипсином
- Трипсин избирательно расщепляет С-концевые остатки лизина или аргинина
-
Масс-спектрометрия пептидов
- Пептиды могут быть обессолены и подвергнуты масс-спектрометрии методом MALDI-TOF
- Прямое измерение массы пептидов может дать информацию для идентификации белка
- Для получения информации о последовательностях пептидов используется дальнейшая фрагментация
-
Альтернативные методы
- Пептиды могут быть разделены с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ и введены в масс-спектрометр с помощью источника ESI
- LC-ESI-MS может предоставить больше информации, но требует больше времени работы прибора
-
Анализ данных
- Информация о массе пептидов сопоставляется с расчетными значениями массы из баз данных белковых последовательностей
- Успешное совпадение оценивается по пороговому значению
- Пакеты программного обеспечения генерируют отчет с идентификацией белков и их оценкой соответствия
-
Повторное секвенирование
- Характер фрагментации пептида позволяет определить его последовательность путем секвенирования de novo
- Эта последовательность может быть использована для сопоставления баз данных или исследования посттрансляционных модификаций
-
Ограничения и посттрансляционные модификации
- Протеолиз не всегда приводит к полному набору пептидов
- Фрагментация пептидов не всегда приводит к образованию ионов, соответствующих каждой пептидной связи
- Посттрансляционные модификации могут быть выявлены при более тщательном изучении данных
-
Определение общей массы белка
- Общая масса белка равна сумме масс его аминокислотных остатков плюс масса молекулы воды
- Белки можно подвергнуть ESI-MS для измерения массы с точностью до 1 части из 20 000
-
Предсказание на основе последовательностей ДНК/РНК
- Белки образуются путем трансляции мРНК, последовательность белка определяется последовательностью кодонов
- Предсказанные белковые последовательности используются для идентификации белков с помощью масс-спектрометрии
-
Инструменты биоинформатики
- Существуют инструменты для интерпретации масс-спектров, сравнения белковых последовательностей и поиска в базах данных
-
Приложения к криптографии
- Сложность секвенирования белка используется для создания k-временных программ