Оглавление
- 1 Секвенирование по Сэнгеру
- 1.1 История и развитие секвенирования по Сэнгеру
- 1.2 Принцип метода
- 1.3 Автоматизация и подготовка образцов
- 1.4 Применение в общественном здравоохранении
- 1.5 Проблемы и ограничения
- 1.6 Клонирование и секвенирование ДНК
- 1.7 Современные методы секвенирования
- 1.8 Микрофлюидное секвенирование по Сэнгеру
- 1.9 Процесс секвенирования по Сэнгеру
- 1.10 Преимущества методов Сэнгера
- 1.11 Применение микрожидкостного секвенирования
- 1.12 Конструкция устройства
- 1.13 Химия секвенирования
- 1.14 Сравнение с другими методами
- 1.15 Полный текст статьи:
- 2 Секвенирование по Сэнгеру
Секвенирование по Сэнгеру
-
История и развитие секвенирования по Сэнгеру
- Метод разработан Фредериком Сэнгером в 1977 году
- Автоматизирован в 1987 году компанией Applied Biosystems
- Заменен на методы секвенирования следующего поколения
-
Принцип метода
- Использует одноцепочечную ДНК-матрицу, ДНК-праймер, ДНК-полимеразу и модифицированные дидезоксинуклеотиды
- ДНК-полимераза прекращает удлинение цепи при включении модифицированного дидезоксинуклеотида
- Образец ДНК разделяется на четыре реакции с разными дидезоксинуклеотидами
- Фрагменты ДНК разделяются по размеру с помощью гель-электрофореза
-
Автоматизация и подготовка образцов
- Автоматизированные приборы секвенируют до 384 образцов в одной партии
- Реакции секвенирования, очистка и повторное взвешивание выполняются отдельно
- Программное обеспечение удаляет некачественные следы ДНК
-
Применение в общественном здравоохранении
- Используется для эпиднадзора за SARS-CoV-2 и норовирусами
- Секвенирование S-гена SARS-CoV-2 обеспечивает быстрый и точный метод
- Секвенирование по Сэнгеру является “золотым стандартом” для эпиднадзора за норовирусами в сети CaliciNet
-
Проблемы и ограничения
- Низкое качество первых 15-40 оснований из-за связывания с праймером
- Ухудшение качества следов секвенирования после 700-900 оснований
- Программное обеспечение для базового вызова помогает отсекать некачественные области последовательностей
-
Клонирование и секвенирование ДНК
- Клонирование перед секвенированием может содержать части клонирующего вектора
- ПЦР и пиросеквенирование позволяют избежать использования векторов
- Одноэтапные методы секвенирования, такие как Ampliseq и SeqSharp, ускоряют процесс
-
Современные методы секвенирования
- Современные методы секвенируют короткие фрагменты ДНК (300-1000 нуклеотидов)
- Недостаточная мощность разделения для больших фрагментов ДНК
-
Микрофлюидное секвенирование по Сэнгеру
- Интегрирует этапы секвенирования в чип размером с пластину
- Автоматизирует этапы, устраняя недостатки традиционного метода
- Обеспечивает длительное и точное считывание
-
Процесс секвенирования по Сэнгеру
- Фрагментация генома на одноцепочечные фрагменты
- Амплификация фрагментов с помощью ПЦР
- Терминация фрагментов флуоресцентно меченым нуклеотидом
- Разделение фрагментов с помощью электрофореза
- Сборка последовательностей в контиги
-
Преимущества методов Сэнгера
- Максимальная длина считывания около 800 п.н.
- Преимущества в секвенировании повторяющихся участков генома
- Быстрое считывание данных для новых геномов и перестроенных сегментов
-
Применение микрожидкостного секвенирования
- Обнаружение SNP, SSCP и STR
- Разделение фрагментов ДНК по размеру и конформации
-
Конструкция устройства
- Чип состоит из трех стеклянных пластин и PDMS мембраны
- Реакционные камеры и каналы для электрофореза
- Установка термоциклирования, камера улавливания/очистки и камера капиллярного электрофореза
-
Химия секвенирования
- Платформа Apollo 100 автоматизирует термоциклирование и очистку
- Требуются субмикролитровые объемы реагентов
-
Сравнение с другими методами
- Увеличенная длина считывания снижает затраты и количество матриц
- Микрофлюидика обеспечивает быструю и простую сборку последовательностей