Синтез искусственных генов

Искусственный синтез генов Искусственный синтез генов Синтез генов используется в синтетической биологии для конструирования и сборки генов из нуклеотидов de […]

Искусственный синтез генов

  • Искусственный синтез генов

    • Синтез генов используется в синтетической биологии для конструирования и сборки генов из нуклеотидов de novo.  
    • Не требует матричной ДНК, что позволяет синтезировать практически любую последовательность ДНК.  
  • Этапы синтеза генов

    • Первый этап: твердофазный синтез ДНК (ДНК-печать).  
    • Второй этап: соединение олигонуклеотидных фрагментов с использованием различных методов сборки ДНК.  
  • История и достижения

    • Первый полноценный ген, дрожжевая тРНК, синтезирован в 1972 году.  
    • Синтезированы первые гены, кодирующие пептид и белок.  
    • Созданы искусственные дрожжевые ТРНК и синтетические хромосомы.  
  • Методы синтеза ДНК

    • Синтез олигонуклеотидов: использование нуклеозидных фосфорамидитов, удаление защитных групп.  
    • Соединение олигонуклеотидов на основе отжига: лигирование фосфорилированных перекрывающихся олигонуклеотидов, метод Fok I, модифицированная форма лигазной цепной реакции.  
  • Ограничения и проблемы

    • Качество олигонуклеотидов влияет на результат синтеза.  
    • Высокая частота ошибок из-за химически синтезированных олигонуклеотидов.  
    • Необходимость оптимизации праймеров и использования специализированных программ.  
  • Процедуры исправления ошибок

    • Использование олигонуклеотидов-ловов, ферментов, связывающих несоответствия, специфических эндонуклеаз.  
    • Массово-параллельное секвенирование для скрининга библиотек сложных олигонуклеотидов.  
  • Неестественные пары оснований

    • Возможность использования неестественных пар оснований для расширения генетического кода.  
    • Успешное включение третьей пары оснований в плазмиду E. coli.  
    • Потенциал для значительного расширения числа аминокислот, кодируемых ДНК.  
  • ДНК-печать и сборка ДНК

    • ДНК-печать используется для получения частей ДНК, кодирующих биологические функции.  
    • Методы сборки ДНК необходимы для создания функциональных генов и хромосом.  
  • Стандарты сборки ДНК

    • Существует множество стандартов сборки ДНК, упрощающих рабочий процесс.  
    • Стандарты определяют протоколы соединения частей ДНК и правила их формата.  
  • Методы сборки ДНК

    • Сборка, опосредованная эндонуклеазами, использует рестрикционные ферменты II типа.  
    • Сборка, основанная на длительном перекрытии, использует самонаводящиеся эндонуклеазы.  
  • BioBricks

    • Стандарт BioBricks определяет последовательности префиксов и суффиксов для сборки ДНК.  
    • BioBricks использует рестрикционные ферменты EcoRI, SpeI и XbaI.  
    • BioBricks считается идемпотентным, но образует «рубцовую» последовательность.  
  • Альтернативные стандарты сборки

    • Разработаны стандарты сборки, такие как BB-2, BglBricks, Silver и Freiburg, для устранения «рубцовой» последовательности.  
  • Сборка с использованием эндонуклеаз типа IIs

    • Эндонуклеазы типа IIs позволяют изменять последовательность выступов для сборки «без царапин».  
    • Методы сборки с использованием эндонуклеаз типа IIs включают Golden Gate и его варианты.  
  • Клонирование Golden Gate

    • Протокол Golden Gate позволяет получить конструкцию без «рубцовой» последовательности и исходных сайтов рестрикции.  
    • Используется рестрикционный фермент BsaI для сборки до 240 уникальных последовательностей.  
  • MoClo и Golden Braid

    • MoClo и Golden Braid позволяют создавать мультигенные конструкции.  
    • MoClo определяет несколько уровней сборки, Golden Braid объединяет уровни попарно.  
    • Используются чередующиеся рестрикционные ферменты BpiI и BsaI для минимизации запрещенных сайтов.  
  • MoClo и Golden Braid

    • MoClo позволяет собирать конструкции из нескольких транскрипционных единиц с помощью Golden Gate реакций.  
    • Golden Braid использует парную сборку Golden Gate, что позволяет избежать использования фиктивных частей.  
  • Site-specific recombination

    • Использует фаговые интегразы вместо рестрикционных ферментов.  
    • Invitrogen Gateway cloning system использует BP и LR клоназы для рекомбинации.  
  • Vector design and assembly

    • Gateway клонирование требует использования специальных наборов.  
    • Включает два этапа: сборка входных клонов и вставка их в целевой вектор.  
    • Multisite Gateway технология позволяет использовать до четырех входных клонов.  
  • Long-overlap-based assembly

    • Включает методы Gibson, CPEC, SLIC и SLiCE.  
    • Gibson assembly метод использует T5 exonuclease, Phusion DNA polymerase и Taq DNA ligase.  
    • MODAL и BASIC стратегии используют специальные линкеры для упрощения сборки.  
  • MODAL

    • Определяет перекрывающиеся последовательности (линкеры) для упрощения сборки.  
    • Использует PCR для присоединения линкеров к частям.  
  • BASIC

    • Разработан в 2015 году для устранения недостатков предыдущих методов.  
    • Включает стандартные многоразовые части, одноуровневый формат, идентпотентное клонирование, параллельную сборку, независимость от размера и автоматизацию.  
    • ДНК части и линкеры разработаны с помощью R2oDNA Designer.  
  • Сборка ДНК

    • Стандарт BASIC assembly включает несколько линкеров с различными RBS.  
    • Для создания слитых белков разработаны линкеры, кодирующие полипептид из 15 аминокислот.  
    • Сборка включает три этапа: вырезание ДНК из плазмиды, присоединение линкеров и сборка в плазмиду.  
  • Применение ДНК-синтеза

    • ДНК-синтез стал дешевле и эффективнее благодаря развитию методов.  
    • Синтетическая биология, гетерологическая экспрессия генов, разработка вакцин и генная терапия выигрывают от быстрых и дешевых методов синтеза ДНК.  
    • ДНК используется как носитель информации.  
  • Синтез бактериальных геномов

    • В 2007 году команда Крейга Вентера успешно пересадила ДНК Mycoplasma mycoides в Mycoplasma capricolum.  
    • В 2010 году синтезировали геном Mycoplasma mycoides и пересадили его в Mycoplasma capricolum, создав жизнеспособную бактерию Synthia.  
  • Синтетические дрожжи

    • Проект Synthetic Yeast 2.0 включает синтез синтетических дрожжей для оптимизации генома Saccharomyces cerevisiae.  
    • В 2014 году синтезировали хромосому III S. cerevisiae, заменив гены на синтетические версии.  
    • В 2017 году завершили синтез 6 из 16 хромосом, остальные находятся в процессе.  

Полный текст статьи:

Синтез искусственных генов

Оставьте комментарий

Прокрутить вверх