Искусственный синтез генов
-
Искусственный синтез генов
- Синтез генов используется в синтетической биологии для конструирования и сборки генов из нуклеотидов de novo.
- Не требует матричной ДНК, что позволяет синтезировать практически любую последовательность ДНК.
-
Этапы синтеза генов
- Первый этап: твердофазный синтез ДНК (ДНК-печать).
- Второй этап: соединение олигонуклеотидных фрагментов с использованием различных методов сборки ДНК.
-
История и достижения
- Первый полноценный ген, дрожжевая тРНК, синтезирован в 1972 году.
- Синтезированы первые гены, кодирующие пептид и белок.
- Созданы искусственные дрожжевые ТРНК и синтетические хромосомы.
-
Методы синтеза ДНК
- Синтез олигонуклеотидов: использование нуклеозидных фосфорамидитов, удаление защитных групп.
- Соединение олигонуклеотидов на основе отжига: лигирование фосфорилированных перекрывающихся олигонуклеотидов, метод Fok I, модифицированная форма лигазной цепной реакции.
-
Ограничения и проблемы
- Качество олигонуклеотидов влияет на результат синтеза.
- Высокая частота ошибок из-за химически синтезированных олигонуклеотидов.
- Необходимость оптимизации праймеров и использования специализированных программ.
-
Процедуры исправления ошибок
- Использование олигонуклеотидов-ловов, ферментов, связывающих несоответствия, специфических эндонуклеаз.
- Массово-параллельное секвенирование для скрининга библиотек сложных олигонуклеотидов.
-
Неестественные пары оснований
- Возможность использования неестественных пар оснований для расширения генетического кода.
- Успешное включение третьей пары оснований в плазмиду E. coli.
- Потенциал для значительного расширения числа аминокислот, кодируемых ДНК.
-
ДНК-печать и сборка ДНК
- ДНК-печать используется для получения частей ДНК, кодирующих биологические функции.
- Методы сборки ДНК необходимы для создания функциональных генов и хромосом.
-
Стандарты сборки ДНК
- Существует множество стандартов сборки ДНК, упрощающих рабочий процесс.
- Стандарты определяют протоколы соединения частей ДНК и правила их формата.
-
Методы сборки ДНК
- Сборка, опосредованная эндонуклеазами, использует рестрикционные ферменты II типа.
- Сборка, основанная на длительном перекрытии, использует самонаводящиеся эндонуклеазы.
-
BioBricks
- Стандарт BioBricks определяет последовательности префиксов и суффиксов для сборки ДНК.
- BioBricks использует рестрикционные ферменты EcoRI, SpeI и XbaI.
- BioBricks считается идемпотентным, но образует «рубцовую» последовательность.
-
Альтернативные стандарты сборки
- Разработаны стандарты сборки, такие как BB-2, BglBricks, Silver и Freiburg, для устранения «рубцовой» последовательности.
-
Сборка с использованием эндонуклеаз типа IIs
- Эндонуклеазы типа IIs позволяют изменять последовательность выступов для сборки «без царапин».
- Методы сборки с использованием эндонуклеаз типа IIs включают Golden Gate и его варианты.
-
Клонирование Golden Gate
- Протокол Golden Gate позволяет получить конструкцию без «рубцовой» последовательности и исходных сайтов рестрикции.
- Используется рестрикционный фермент BsaI для сборки до 240 уникальных последовательностей.
-
MoClo и Golden Braid
- MoClo и Golden Braid позволяют создавать мультигенные конструкции.
- MoClo определяет несколько уровней сборки, Golden Braid объединяет уровни попарно.
- Используются чередующиеся рестрикционные ферменты BpiI и BsaI для минимизации запрещенных сайтов.
-
MoClo и Golden Braid
- MoClo позволяет собирать конструкции из нескольких транскрипционных единиц с помощью Golden Gate реакций.
- Golden Braid использует парную сборку Golden Gate, что позволяет избежать использования фиктивных частей.
-
Site-specific recombination
- Использует фаговые интегразы вместо рестрикционных ферментов.
- Invitrogen Gateway cloning system использует BP и LR клоназы для рекомбинации.
-
Vector design and assembly
- Gateway клонирование требует использования специальных наборов.
- Включает два этапа: сборка входных клонов и вставка их в целевой вектор.
- Multisite Gateway технология позволяет использовать до четырех входных клонов.
-
Long-overlap-based assembly
- Включает методы Gibson, CPEC, SLIC и SLiCE.
- Gibson assembly метод использует T5 exonuclease, Phusion DNA polymerase и Taq DNA ligase.
- MODAL и BASIC стратегии используют специальные линкеры для упрощения сборки.
-
MODAL
- Определяет перекрывающиеся последовательности (линкеры) для упрощения сборки.
- Использует PCR для присоединения линкеров к частям.
-
BASIC
- Разработан в 2015 году для устранения недостатков предыдущих методов.
- Включает стандартные многоразовые части, одноуровневый формат, идентпотентное клонирование, параллельную сборку, независимость от размера и автоматизацию.
- ДНК части и линкеры разработаны с помощью R2oDNA Designer.
-
Сборка ДНК
- Стандарт BASIC assembly включает несколько линкеров с различными RBS.
- Для создания слитых белков разработаны линкеры, кодирующие полипептид из 15 аминокислот.
- Сборка включает три этапа: вырезание ДНК из плазмиды, присоединение линкеров и сборка в плазмиду.
-
Применение ДНК-синтеза
- ДНК-синтез стал дешевле и эффективнее благодаря развитию методов.
- Синтетическая биология, гетерологическая экспрессия генов, разработка вакцин и генная терапия выигрывают от быстрых и дешевых методов синтеза ДНК.
- ДНК используется как носитель информации.
-
Синтез бактериальных геномов
- В 2007 году команда Крейга Вентера успешно пересадила ДНК Mycoplasma mycoides в Mycoplasma capricolum.
- В 2010 году синтезировали геном Mycoplasma mycoides и пересадили его в Mycoplasma capricolum, создав жизнеспособную бактерию Synthia.
-
Синтетические дрожжи
- Проект Synthetic Yeast 2.0 включает синтез синтетических дрожжей для оптимизации генома Saccharomyces cerevisiae.
- В 2014 году синтезировали хромосому III S. cerevisiae, заменив гены на синтетические версии.
- В 2017 году завершили синтез 6 из 16 хромосом, остальные находятся в процессе.