Капиллярный электрофорез
-
Капиллярный электрофорез (КЭ)
- Семейство электрокинетических методов разделения
- Включает CZE, CGE, CIEF, капиллярный изотахофорез и MEKC
- Анализируемые вещества мигрируют через растворы электролитов под воздействием электрического поля
-
Приборы и компоненты
- Основные компоненты: пробирка с образцом, пробирки с источником и местом назначения, капилляр, электроды, высоковольтный источник питания, детектор, устройство для вывода и обработки данных
- Исходный флакон, целевой флакон и капилляр заполняются электролитом
- Образец вводится в капилляр с помощью капиллярного воздействия, давления, сифонирования или электрокинетики
- Миграция анализируемых веществ инициируется электрическим полем
-
Обнаружение
- Разделение может быть обнаружено несколькими детекторами
- Большинство систем используют поглощение в ультрафиолетовом или видимом диапазоне
- Капилляры покрыты полимером для повышения гибкости, но часть для УФ-детекции должна быть оптически прозрачной
- Для повышения чувствительности можно увеличить длину пути, но это снижает разрешение
- Детекция флуоресценции используется для образцов с флуоресцентными метками
- Лазерно-индуцированная флуоресценция обеспечивает высокую чувствительность
-
Способы разделения
- Разделение зависит от дифференциальной миграции анализируемых веществ в электрическом поле
- Скорость миграции зависит от электрофоретической подвижности и напряженности поля
- Нейтральные анализируемые вещества плохо разделяются
- Скорость миграции также зависит от скорости электроосмотического потока буферного раствора
-
Электроосмотический поток
- Электроосмотический поток направляется к отрицательно заряженному катоду.
- Буфер перетекает через капилляр из исходного флакона в конечный.
- Анализируемые вещества мигрируют к электроду с противоположным зарядом.
-
Скорость электроосмотического потока
- Скорость электроосмотического потока зависит от электроосмотической подвижности и напряженности электрического поля.
- Электроосмотическая подвижность определяется как отношение диэлектрической проницаемости и дзета-потенциала стенки капилляра.
-
Электрофоретическая подвижность
- Электрофоретическая подвижность анализируемых веществ определяется их зарядом и диэлектрической проницаемостью буферного раствора.
- Электрофоретическая подвижность может быть определена экспериментально.
-
Порядок миграции
- Мелкие многозарядные катионы мигрируют быстро, а мелкие многозарядные анионы задерживаются.
- Электроосмотический поток буферного раствора обычно больше, чем электрофоретическая подвижность анализируемых веществ.
-
Электроосмотический поток в капиллярах
- Электроосмотический поток наблюдается при приложении электрического поля к раствору в капилляре с фиксированными зарядами.
- Заряд накапливается на внутренней поверхности капилляра при помещении буферного раствора.
- Ионизация стенки капилляра усиливается при пропускании основного раствора перед введением буферного раствора.
-
Подавление электроосмотического потока
- Внутренняя поверхность капилляра может быть покрыта полимерами или поверхностно-активными веществами для снижения электроосмотического потока.
- Один из подходов — создание ковалентно связанного слоя линейного полиакриламида.
-
Эффективность и разрешающая способность
- Эффективность разделения определяется как количество теоретических пластин, умноженное на напряженность электрического поля.
- Эффективность ограничена диффузией и пропорциональна напряженности электрического поля.
- Наилучшее разрешение достигается при максимальной напряженности поля, при которой джоулев нагрев незначителен.
- Капилляры с меньшим внутренним диаметром позволяют использовать более высокую напряженность поля, но требуют большего давления и времени для введения буфера и образца.
- Эффективность капиллярного электрофореза выше, чем у ВЭЖХ, из-за отсутствия массопереноса между фазами и плоского профиля потока.
- Теоретически для разделения может быть использовано несколько сотен тысяч пластин.
- Резолюция результатов разделения определяется как отношение разности электрофоретической подвижности к сумме подвижностей.
-
Факторы, снижающие разрешающую способность капиллярного электрофореза
- Диффузия и джоулев нагрев
- Конечная ширина инжекционной пробки и окна детектирования
- Взаимодействие между анализируемым веществом и стенкой капилляра
- Инструментальные неидеальности
- Неравномерность электрического поля
- Истощение буферной емкости резервуаров
- Электродисперсия
-
Применение капиллярного электрофореза в судебной медицине
- Определение ионов в слюне
- Амплификация и обнаружение фрагментов ДНК с помощью ПЦР
- Разделение ДНК с использованием тонких капилляров из плавленого кремнезема
- Обнаружение с помощью флуоресценции через окошко в капилляре
- Использование капиллярных матриц для увеличения производительности
-
Применение капиллярного электрофореза в криминалистике
- Определение STR по биологическим образцам
- Обнаружение специфических фрагментов мРНК
- Анализ чернил для струйной печати
- Мицеллярная электрофоретическая капиллярная хроматография (MECC)
-
Аффинный капиллярный электрофорез (АПФ)
- Использование межмолекулярных связывающих взаимодействий
- Анализ и модификация специфических аффинных реагентов
- Модифицированные аптамеры с высокой аффинностью связывания
-
Секвенирование ДНК с помощью капиллярного электрофореза
- Высокая пропускная способность и точность
- Использование CE-чипа для секвенирования фрагментов ДНК
- Флуоресценция для определения концентраций нуклеиновых кислот