Синтез олигонуклеотидов
-
Синтез олигонуклеотидов
- Химический синтез коротких фрагментов нуклеиновых кислот
- Обеспечивает быстрый и недорогой доступ к олигонуклеотидам
- Осуществляется в направлении от 3′ к 5′
-
Методы синтеза
- Твердофазный синтез с использованием фосфорамидитных строительных блоков
- Строительные блоки: 2′-дезоксинуклеозиды, рибонуклеозиды, химически модифицированные нуклеозиды
- Процесс автоматизирован с конца 1970-х годов
-
Ограничения и применение
- Длина олигонуклеотидов ограничена до 200 нуклеотидов из-за побочных реакций
- Продукты выделяют с помощью ВЭЖХ для высокой чистоты
- Олигонуклеотиды используются в молекулярной биологии и медицине
-
История синтеза
- Ранние работы с Н-фосфонатом и триэфирным фосфатом
- Н-фосфонатный метод: окисление межнуклеозидных связей в конце сборки
- Фосфодиэфирный метод: образование пирофосфатных олигомеров
- Фосфотриэфирный метод: защита фосфатной части, высокая селективность
- Синтез сложного фосфита: использование 3′-О-хлорфосфитов, 1Н-тетразолидофосфитов
-
Современные методы
- Синтез фосфорамидитным методом: использование нуклеозидных фосфорамидитов
- Защитные группы: 5′-гидроксильная группа защищена ДМТ, тимин и урацил не требуют защиты
- Аденин и цитозин требуют защиты аминогрупп, но возможны альтернативные подходы
-
Защита экзоциклических аминогрупп
- Экзоциклические аминогруппы защищены по всей длине олигонуклеотидной цепи
- Защита должна быть ортогональной защите 5′-гидроксигруппы
- Используются две схемы защиты: стандартная и мягкая
-
Стандартная схема защиты
- Bz (бензоил) для A, dA, C и dC
- Изобутирильная группа для G и dG
- Ac (ацетильная) группа для C и dC
-
Мягкая схема защиты
- Изобутириловые или феноксиацетильные группы для A и dA
- Ацетильная защита для C и dC
- 4-изопропилфеноксиацетильные или диметилформамидиногруппы для G и dG
-
Фосфитная группа
- Защищена лабильной к основанию 2-цианоэтиловой группой
- После соединения с олигонуклеотидом фосфитные фрагменты преобразуются в P(V)-частицы
-
Ненуклеозидные фосфорамидиты
- Используются для введения функциональных добавок
- Обладают по меньшей мере двумя гидроксигруппами
- Примеры: 5′-концевые фосфатные, NH2, SH, альдегидные и карбоновые группы
-
Цикл синтеза
- Включает четыре химические реакции: снятие блокировки, соединение, укупорка, окисление
- Снятие блокировки: удаление группы ДМТ кислотой
- Соединение: активация фосфорамидита и его контакт с твердым носителем
- Укупорка: обработка уксусным ангидридом и 1-метилимидазолом
- Окисление: обработка йодом и водой для превращения фосфитного триэфира в фосфатный триэфир
-
Твердый опорный материал
- Олигонуклеотид связывается с твердым носителем через 3′-концевую гидроксигруппу
- Твердая подложка содержится в колонках или ячейках многолуночных планшетов
- В конце сборки олигонуклеотид высвобождается и элюируется
-
Синтез олигонуклеотидов на твердых подложках
- Синтез олигонуклеотидов лучше всего протекает на не набухающих или слабо набухающих твердых подложках.
- Наиболее часто используемые материалы: стекло с контролируемыми порами (CPG) и макропористый полистирол (MPPS).
- CPG определяется по размеру пор, MPPS — по степени поперечной сшивки.
-
Химический состав линкеров
- Ненуклеозидные линкеры или сукцинаты нуклеозидов ковалентно присоединяются к аминогруппам в CPG, LCAA CPG или MPPS.
- Оставшиеся аминогруппы покрывают уксусным ангидридом.
-
Универсальные опоры
- Синтез начинается с универсального носителя, где ненуклеозидный линкер прикрепляется к твердому материалу.
- Фосфорамидит соединяется с универсальной твердой подложкой, затем сборка продолжается до завершения.
- Высвобождение олигонуклеотидов происходит путем гидролитического расщепления связи P-O.
-
Твердые носители из нуклеозидов
- 3′-гидроксигруппа 3′-концевого нуклеозидного остатка присоединяется к твердому носителю.
- Сборка начинается с присоединения фосфорамидитного структурного элемента.
- 3′-концевая гидроксигруппа снимается с защиты в более мягких условиях.
-
Олигонуклеотидные фосфоротиоаты
- Олигонуклеотидные фосфоротиоаты (OPS) содержат серу в фосфатной части.
- OPS устойчивы к гидролизу нуклеазами и используются в качестве антисмысловых олигонуклеотидов.
- Синтез OPS включает реакцию переноса серы и стадию укупорки.
-
Автоматизация синтеза олигонуклеотидов
- В прошлом синтез осуществлялся вручную, сейчас используется автоматизация.
- Синтезаторы олигонуклеотидов работают в форматах колонок, многолуночных планшетов и матриц.
-
История средне- и крупномасштабного синтеза
- Первые синтезаторы среднего уровня появились в конце 1980-х годов.
- В середине 1990-х годов разработаны платформы на основе жидкостных хроматографов.
- Genomic Technologies разработала первый крупномасштабный синтезатор олигонуклеотидов.
-
Синтез олигонуклеотидов
- Фабрики разрабатывают собственные платформы для синтеза олигонуклеотидов.
- Дизайн VLSS совершенствуется, включая синтезатор QMaster.
- Обзор методов синтеза химически модифицированных олигонуклеотидов.
-
Синтез олигонуклеотидных микрочипов
- Микрочипы представляют собой миниатюрные пластины с лунками.
- Олигонуклеотиды остаются прикрепленными к твердой фазе.
- Используются линкеры, стабильные в условиях снятия защиты.
- Методы 5′-снятия защиты включают электрохимическое генерирование кислоты и облучение ультрафиолетом.
-
Пост-синтетическая обработка
- Олигонуклеотиды защищены DMT-группой, 2-цианоэтильными группами и ацильными защитными группами.
- Удаление защитных групп требует обработки основаниями или аминами.
- Обработка растворами оснований в органическом растворителе предотвращает образование побочных продуктов.
-
Снятие защиты
- 5′-DMT-группа удаляется в конце сборки цепи.
- Олигонуклеотиды обрабатываются гидроксидом аммония, метиламином или аммиаком.
- 2′-О-защищенные остатки удаляются ионами фтора.
- Продукт очищается осаждением этанолом, эксклюзионной хроматографией или обратнофазной ВЭЖХ.
-
Характеристика олигонуклеотидов
- Олигонуклеотиды характеризуются после снятия защиты и очистки.
- Используются масс-спектрометрия с электрораспылением (ESI MS) и MALDI-TOF.
- Ионы металлов заменяются на аммоний или триалкиламмоний.
- Программное обеспечение вычисляет молекулярную массу олигонуклеотида.
- Для определения примесей используются ЖХ-МС или CEMS.