Высокоэффективная жидкостная хроматография
-
Основы ВЭЖХ
- Метод аналитической химии для разделения, идентификации и количественного определения компонентов в смесях
- Использует насосы высокого давления для подачи подвижной фазы через колонку с адсорбентом
- Компоненты образца взаимодействуют с адсорбентом, что приводит к разделению
-
Процесс разделения
- Компоненты образца перемещаются через колонку с разной скоростью
- Время удерживания компонента зависит от его химической природы и состава подвижной фазы
- Детекторы, такие как УФ-детекторы, регистрируют сигнал, пропорциональный количеству компонента
-
Применение ВЭЖХ
- Используется в промышленности, юридических целях, научных исследованиях и медицине
- Применяется для анализа фармацевтических препаратов, биологических образцов и других сложных смесей
-
Оборудование и технология
- Включает резервуары для растворителей, насосы, дегазатор, пробоотборник, колонку и детектор
- Насосы обеспечивают требуемый расход и состав подвижной фазы
- Детекторы генерируют сигнал, пропорциональный количеству компонента, и отмечают время появления и время удержания
-
Типы колонок и адсорбентов
- Колонки заполнены адсорбентами с различными размерами частиц и химическим составом поверхности
- Использование мелких частиц адсорбента улучшает разрешающую способность
- Адсорбенты могут быть ионными, гидрофобными или полярными
-
Методы и условия
- Наиболее распространенный метод — обратнофазный, с использованием воды и органических растворителей
- Изократическое элюирование эффективно для простых смесей, градиентное элюирование для сложных
- Состав подвижной фазы зависит от интенсивности взаимодействий между компонентами образца и адсорбентом
-
История и развитие
- До ВЭЖХ использовались настольные колонки, неэффективные из-за зависимости от силы тяжести
- ВЭЖХ значительно ускорила процесс разделения и улучшила его точность
-
История и развитие ВЭЖХ
- Газовая хроматография была более мощной, но не подходила для анализа биомолекул.
- В 1941 году Мартин и Синдж предложили использовать ЖХ с уменьшенным диаметром частиц и давлением.
- В 1960-х годах Гиддингс и Хубер предсказали, что ЖХ может работать в высокоэффективном режиме.
-
Эволюция технологии частиц
- В 1970-х годах были разработаны насосы и форсунки для ВЭЖХ.
- В Dupont IPD были достигнуты важные технические успехи.
- Уменьшение размера частиц привело к новым проблемам, таким как чрезмерное давление и сложность упаковки.
-
Типы хроматографии
- Разделительная хроматография использует удерживаемый растворитель и полярные взаимодействия.
- Нормофазная хроматография основана на полярных взаимодействиях с поверхностью сорбента.
- Вытеснительная хроматография использует вытеснитель для конкуренции за сайты связывания.
- Обращенно-фазовая хроматография использует неполярную стационарную фазу и водную подвижную фазу.
-
Преимущества и недостатки методов
- Разделительная хроматография эффективна для разделения полярных веществ.
- Нормофазная хроматография эффективна для разделения легко растворимых веществ.
- Вытеснительная хроматография используется для препаративной хроматографии.
- Обращенно-фазовая хроматография является наиболее распространенным методом благодаря своей универсальности.
-
Методы разделения биомедицинских материалов
- Используются колонки типа C-18, такие как ODS или RP-18
- Стационарные фазы основаны на кремнеземной подложке с модифицированной поверхностью
- Время удерживания зависит от полярности молекул и растворителя
-
Принцип гидрофобных взаимодействий
- RP-ВЭЖХ основана на гидрофобных взаимодействиях
- Связывание анализируемого вещества с неподвижной фазой пропорционально площади поверхности контакта
- Удерживание уменьшается при добавлении менее полярного растворителя
-
Влияние структурных свойств молекул
- Молекулы с большей гидрофобной поверхностью удерживаются дольше
- Молекулы с большей полярной поверхностью удерживаются меньше
- Пространственные эффекты и эффекты исключения влияют на удерживание
-
Влияние рН и буферов
- рН влияет на гидрофобный характер ионизируемых веществ
- Буферы регулируют рН и заряд поверхности кремнезема
- Формиат аммония и летучие органические кислоты улучшают обнаружение аналитов
-
Повреждение колонок и хранение
- Колонки с обращенной фазой устойчивы к гидролизу, но не подходят для водной основы
- Гибридные частицы на основе диоксида кремния могут использоваться в экстремальных условиях pH
- Колонки следует промывать и хранить в соответствующем растворителе
-
Хроматография с исключением размера
- Метод SEC разделяет полимерные молекулы и биомолекулы по размеру
- Процесс основан на проникновении молекул через поры гелевых сфер
- GPC используется для синтетических полимеров, GFC для водорастворимых биополимеров
-
Принцип разделения в SEC
- Элюент исключает взаимодействие с поверхностью неподвижной фазы
- Молекулы разделяются в порядке уменьшения молекулярной массы
- SEC используется для анализа крупных молекул и определения молекулярной массы полисахаридов
-
Ионообменная хроматография
- Метод разделения ионных растворенных веществ
- Удержание основано на притяжении между ионами и заряженными участками колонки
- Типы ионообменников: полистирольные смолы, целлюлозные и декстрановые ионообменники, стекло с регулируемыми порами
- Полистирольные смолы обеспечивают высокую стабильность цепи
- Целлюлозные и декстрановые ионообменники подходят для разделения белков
-
Биоаффинная хроматография
- Пропускание раствора пробы через колонку с иммобилизованным лигандом
- Лиганд связывается с молекулой-мишенью, другие молекулы проходят через колонку
- Целевую молекулу элюируют подходящим буфером
- Образование комплексов основано на биологическом распознавании компонентов образца
-
Водная хроматография в нормальной фазе
- Метод, охватывающий область между обращенно-фазовой и органической хроматографией
- Используется для анализа гидрофильных соединений
- Легко соединяется с MS
-
Изократическое и градиентное элюирование
- Изократическое элюирование: постоянный состав подвижной фазы
- Градиентное элюирование: изменение состава подвижной фазы
- Изократическое элюирование: ширина пика линейно увеличивается со временем удерживания
- Градиентное элюирование: улучшает разделение и форму пиков
-
Параметры ВЭЖХ
- Коэффициент полезного действия (N)
- Коэффициент удерживания (kappa prime)
- Коэффициент разделения (альфа)
-
Уравнение разрешения
- Описывает, насколько хорошо пики компонентов разделены или перекрываются
- Используется для разделения фаз методом ВЭЖХ с обращенной фазой и нормального разделения фаз
-
Пустой объем
- Объем пространства в колонне, занимаемый растворителем
- Используется как поправочный коэффициент
-
Коэффициент эффективности (N)
- Измеряет резкость пиков компонента
- Зависит от колонки и метода ВЭЖХ
-
Коэффициент удерживания (kappa prime)
- Измеряет время удерживания компонента в колонке
- Корректируется с учетом объема пустот
-
Коэффициент разделения (альфа)
- Относительное сравнение разделения двух соседних компонентов
-
Внутренний диаметр колонки
- Влияет на реакцию обнаружения и селективность разделения
- Определяет количество анализируемого вещества
-
Размер частиц
- Влияет на площадь поверхности и разделение
- Давление насоса влияет на скорость и эффективность
-
Размер пор
- Влияет на площадь поверхности и кинетику
- Размер пор важен для крупных анализируемых веществ
-
Давление насоса
- Современные системы работают при высоких давлениях
- UHPLC работает при давлении до 120 МПа
-
Детекторы
- Универсальные и селективные детекторы
- Детекторы поглощения и показателя преломления
- Электрохимический детектор для обнаружения нейромедиаторов
-
Автосамплеры
- Автоматически вводят образцы в систему ВЭЖХ
- Обеспечивают высокую точность и однородность проб
-
Приложения
- Производство фармацевтических препаратов
- Обнаружение запрещенных наркотиков
- Исследование различных веществ
-
Применение ВЭЖХ в медицине и науке
- ВЭЖХ используется для определения концентраций потенциальных клинических кандидатов, таких как противогрибковые препараты и препараты от астмы.
- Метод полезен для наблюдения за несколькими видами в образцах, но требует стандартных решений для идентификации видов.
- ВЭЖХ используется для подтверждения результатов реакций синтеза, так как чистота важна в таких исследованиях.
-
Медицинское применение ВЭЖХ
- В медицине ВЭЖХ обычно используется с масс-спектрометром (МС), что называется LC-MS или LC-MS/MS.
- ВЭЖХ применяется в фармацевтике, фармакологии, персонализированной медицине, общественном здравоохранении и диагностике.
- Моча и сыворотка крови являются основными средами для анализа концентрации лекарственных средств.
- ВЭЖХ используется для скрининга новорожденных на метаболические нарушения и последующей диагностики.
-
Сравнение с другими методами
- ВЭЖХ превосходит иммунологические анализы по чувствительности и специфичности.
- В одном из примеров, чувствительность и специфичность CPBA для определения витамина D составляют 40% и 60% от возможностей ВЭЖХ.
-
История и развитие хроматографии
- ВЭЖХ является одним из методов хроматографии, наряду с капиллярной электрохроматографией, колоночной хроматографией и другими.
- ВЭЖХ имеет долгую историю развития и множество применений в различных областях.