Молекулярное клонирование
-
Молекулярное клонирование
- Набор методов для сборки рекомбинантных молекул ДНК и их репликации в организмах-хозяевах
- Включает репликацию одной молекулы для получения популяции клеток с идентичными ДНК
-
Процесс молекулярного клонирования
- ДНК из интересующего организма обрабатывается ферментами для получения фрагментов
- Фрагменты объединяются с векторной ДНК для создания рекомбинантных молекул
- Рекомбинантная ДНК вводится в организм-хозяин, обычно E. coli
- Создается популяция организмов с рекомбинантными молекулами ДНК
-
История и развитие
- До 1970-х годов генетика и молекулярная биология были затруднены
- Появление методов молекулярного клонирования изменило ситуацию
- Микробиологи выделили эндонуклеазы рестрикции для расщепления ДНК
-
Обзор и моделирование
- Молекулярное клонирование использует сходство ДНК у всех организмов
- ПЦР и молекулярное клонирование различаются по способу репликации ДНК
- Программное обеспечение для моделирования клонирования включает ApE, DNAStrider, Serial Cloner и другие
-
Шаги молекулярного клонирования
- Выбор организма-хозяина и вектора
- Получение векторной ДНК
- Подготовка ДНК для клонирования
- Создание рекомбинантной ДНК
- Введение рекомбинантной ДНК в организм-хозяина
- Отбор организмов с рекомбинантной ДНК
- Скрининг клонов с желаемыми вставками ДНК
-
Выбор организма-хозяина и вектора
- E. coli и плазмидные векторы широко используются
- Специализированные векторы включают бактериальные искусственные хромосомы и дрожжевые искусственные хромосомные векторы
- Векторы содержат источник репликации, сайты рестрикции, генетический маркер и ген-метку
-
Получение векторной ДНК
- Вектор обрабатывают эндонуклеазой рестрикции для создания сайтов для вставки чужеродной ДНК
- Вектор расщепляется в месте, совместимом с концами чужеродной ДНК
- Вектор может быть дефосфорилирован для улучшения соотношения рекомбинантных и нерекомбинантных организмов
-
Подготовка ДНК для клонирования
- ДНК извлекается из интересующего организма
- ДНК очищается от загрязняющих белков, РНК и мелких молекул
-
Скрининг клонов
- Клоны отбираются по наличию рекомбинантной ДНК и биологическим свойствам
-
Методы полимеразной цепной реакции
- Используются для амплификации ДНК или РНК перед молекулярным клонированием
- ДНК может быть получена из РНК с помощью обратной транскриптазы или синтезирована
-
Клонирование кДНК и синтетической ДНК
- Клонирование кДНК используется для получения клонов мРНК
- Синтетическая ДНК используется для получения точных последовательностей
-
Создание рекомбинантной ДНК
- ДНК из вектора и чужеродного источника смешивают и обрабатывают ДНК-лигазой
- Полученная смесь ДНК готова к введению в организм хозяина
-
Введение рекомбинантной ДНК в организм хозяина
- Смесь ДНК вводится в клетки с помощью различных методов (трансформация, трансдукция, трансфекция, электропорация)
- Клетки, не усвоившие ДНК, уничтожаются, выживают только клетки с маркерным геном
-
Отбор организмов с векторными последовательностями
- Используются методы искусственного генетического отбора
- В бактериальных клетках маркерный ген придает устойчивость к антибиотику
- В клетках млекопитающих маркерный ген придает устойчивость к генетическому антибиотику
-
Скрининг на наличие клонов
- Современные векторы используют сине-белую систему скрининга
- Колонии с рекомбинантной ДНК остаются бесцветными
-
Приложения молекулярного клонирования
- Организация генома и экспрессия генов
- Получение рекомбинантных белков
- Создание трансгенных организмов
- Генная терапия
-
Генная терапия зародышевой линии
- Неэтична по отношению к людям
- Воздействие на зародышевые клетки
-
Генная терапия соматическими клетками
- Аналогична трансплантации органов
- Воздействие на специфические ткани
- Удаление ткани, добавление терапевтического гена, возвращение обработанных клеток пациенту
-
Клинические испытания
- Начались в конце 1990-х годов
- Лечение рака, заболеваний крови, печени и легких
-
Ограниченный успех
- Эффект часто частичный и временный
- Неблагоприятные последствия лечения, включая летальные исходы
-
Побочные эффекты
- Нарушение работы важных генов
- Заражение вирусных векторов инфекционным вирусом
-
Будущее генной терапии
- Многообещающая область медицины
- Значительный уровень научных исследований и разработок